一种检测细胞转化基因的新方法
作者：段朝军 李宗海 何春梅 田芳 关勇军 袁建辉 陈主初
单位：段朝军 李宗海 何春梅 田芳 关勇军 袁建辉 陈主初(湖南医科大学肿瘤研究所,湖南长沙410078)
关键词：共转染；转化基因或瘤基因
癌症000537
中图分类号：R730.26文献标识码：B
文章编号：1000-467X(2000)05-0502-02
从化学诱发的肿瘤或转化的细胞中分析瘤基因及其活化有助于从分子、基因水平阐明肿瘤形成的机理。以往的瘤基因分析方法大多数采用以NIH3T3为受体细胞的DNA转染分析，但该方法主要根据DNA转染后细胞形态改变，即折光性加强和停泊非依赖性生长来检测活化瘤基因，因此，存在一定局限性。Fasano及Brown分别采用共转染及裸鼠致瘤性分析，检测到乳腺癌细胞系MCF-7和烷化剂诱发的大鼠鼻咽鳞癌中存在相应转化基因并进行了克隆[1,2]。本研究以人膀胱癌细胞系T24为实验对象建立了检测细胞转化基因的新方法。
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1材料与方法
1.1细胞系、质粒及动物来源
小鼠成纤维细胞系NIH3T3(CRL-1659)购自美国ATCC，人膀胱癌细胞系T24、质粒pKj1-neo、Blur8及pSV2-rasH系本所保存，裸鼠(BALB/c,nu/nu)(4周龄)购自中国科学院上海实验动物中心。
1.2主要试剂
胎牛血清、培养基DMEM、1640均系U.S.A.Hyclone产品,分子生物学试剂如随机引物标记试剂盒、限制性核酸内切酶等购自U.S.A.GIBCO公司，转染试剂盒FuGENTM6系U.S.A.Roche公司产品，同位素α-32P-dCTP(111GBq/mol)系北京亚辉公司产品，其它常用试剂为国产分析纯。
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1.3方法
质粒/真核细胞DNA的提取、酶切、电泳、探针回收以及Southern分析按文献方法进行[3]，人重复序列Alu/H-ras探针标记、细胞转染按各自说明书进行。
2实验结果
2.1肿瘤细胞DNA共转染
将肿瘤细胞T24及NIH3T3细胞DNA各30μg分别与0.3μg质粒pKj1-neo混匀、脂质包埋后，加入到含5×105/平皿(100mm)对数期生长NIH3T3细胞的培养品皿中，6小时后换上含10%胎牛血清DMEM培养基继续培养，72小时后，1∶5稀释，同时加入终浓度400μg/mlG418DMEM完全培养基(含青霉素、链霉素各100U/ml)筛选，十天后见每个平皿长出约300个抗性克隆，两周后，0.1%胰酶消化细胞，并将每组细胞集中(每组抗性克隆数≥1000)，计数后接种于4周龄裸鼠(BALB/c)右腋窝皮下(107/0.5ml/只)。阴性对照即未加质粒pKj1-neoDNA组细胞筛选十天后全部死亡。
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2.2转染细胞致瘤性检测
接种经人膀胱癌细胞T24DNA与标记基因共转染的NIH3T3细胞的三只裸鼠，两周后于接种部位全部长出肿块，见图1。
取裸鼠肿块，作病理学分析，结果均为纤维肉瘤,提示T24细胞基因组中含有使细胞发生恶性变的转化基因。为了证实裸鼠长出之肿块是由于外源性转染了细胞T24转化基因的NIH3T3细胞所诱发，而非裸鼠本身自发所致，从裸鼠肿块细胞中提取DNA与32P标记的人体重复序列Alu探针进行Southern杂交，结果见图2。
图1接种共转染人膀胱癌细胞T24DNA的G418抗性克隆的裸鼠(箭头示肿块)
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图2裸鼠肿块DNA与人重复序列Alu的分子杂交
1Markerλ/HindDNA
2共转染NIH3T3细胞DNA的G418抗性克隆的DNA
3～5裸鼠肿块DNA
从图2中清楚看到接种T24DNA共转染的NIH3T3细胞的三只裸鼠肿块DNA均有Alu序列杂交的区带，说明裸鼠肿块是由于外源性转染了T24细胞转化基因的NIH3T3细胞所诱发。用限制性核酸内切酶BamHI酶解提取的裸鼠肿块DNA，将其与32P标记的H-ras癌基因探针作分子杂交，放射自显影结果见图3。
从图3中可清晰看到在6.6Kb处有与H-ras癌基因杂交带。由此可知，肿瘤细胞T24基因组中存在活化细胞瘤基因H-ras。接种经NIH/3T3细胞的DNA与标记基因共转染的NIH3T3细胞的三只裸鼠，九周均未长出肿块。
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3讨论
本研究以人膀胱癌细胞系T24为实验对象采用肿瘤细胞DNA与选择标记(neo)共转染和裸鼠致瘤性分析，成功地检测其存在活化的细胞转化基因。采用此法来检测和分析细胞转化基因是基于以下理由：首先，以往的瘤基因分析方法，大多数采用以NIH3T3为受体细胞的DNA转染分析，但该方法主要根据外源性DNA导入后的细胞形态转化，即折光性加强和停泊非依赖性生长来检测活化瘤基因，因此主观性强，且未经G418的预筛，不能有效地除去未掺入外源DNA自发转化的NIH3T3细胞。采用与选择标记(neo)DNA进行共转染，经G418预筛获得少量仅掺入和表达外源DNA的NIH3T3细胞去诱导裸鼠致瘤，可增加检测的特异性。其次，文献报道标记基因可增加外源性DNA的掺入，且每个掺入标记基因的细胞约掺入3×103Kb外源性DNA，若有103个G418抗性集落则掺入3×106KbDNA即相当于一个基因组的DNA量，增加其检测有效性[4]，而本方法通过计数可保证每次实验G418抗性集落数。再者，两周后每个G418抗性集落长至约104个细胞，因此，即使致瘤性很弱的细胞群体，也能检测出来。最后，裸鼠致瘤性分析不仅能检测肿瘤中因基因结构突变而活化的瘤基因，而且还可确定具有转化潜能的高度扩增的基因，增加检测的可靠性[1]。因此，本法在确定化学致癌物诱导的肿瘤或转化细胞系的活化瘤基因，以及深入研究瘤基因及其活化方式与肿瘤形成的分子机理方面有着重要意义。
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图3裸鼠肿块DNA与细胞瘤基因H-ras的分子杂交
1Markerλ/HindDNA
2共转染NIH3T3细胞DNA的G418抗性克隆的DNA
3～5裸鼠肿块DNA
基金项目:本课题受国家自然科学基金(编号39470777、3977064)资助
[参考文献]
1，Fasano O, Birnbaum D, Edlund L, et al. New human transforming genes detected by tumorigenicity assay [J]. Mol Cell Biol， 1984， 4 (9)： 1695～ 1705.
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2，Brown R, Brady G, Mattern J, et al. An alterantive assay system for the detection of transforming genes [J]. Carcinogenesis,1984, 5 (10) ： 1323～ 1328.
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning： A laboratory Mannal [M]. 2nd ed . New York： Cold Spring Harbor, 1989： 456～ 572.
4，Perucho M, Hanahan D, Wigler M. Genetic and physical linkagen of exogenous sequences in transformed cells [J]. Cell, 1980, 22： 309～ 317.
收稿日期:1999-09-22;修回日期:1999-11-12, http://www.100md.com
单位：段朝军 李宗海 何春梅 田芳 关勇军 袁建辉 陈主初(湖南医科大学肿瘤研究所,湖南长沙410078)
关键词：共转染；转化基因或瘤基因
癌症000537
中图分类号：R730.26文献标识码：B
文章编号：1000-467X(2000)05-0502-02
从化学诱发的肿瘤或转化的细胞中分析瘤基因及其活化有助于从分子、基因水平阐明肿瘤形成的机理。以往的瘤基因分析方法大多数采用以NIH3T3为受体细胞的DNA转染分析，但该方法主要根据DNA转染后细胞形态改变，即折光性加强和停泊非依赖性生长来检测活化瘤基因，因此，存在一定局限性。Fasano及Brown分别采用共转染及裸鼠致瘤性分析，检测到乳腺癌细胞系MCF-7和烷化剂诱发的大鼠鼻咽鳞癌中存在相应转化基因并进行了克隆[1,2]。本研究以人膀胱癌细胞系T24为实验对象建立了检测细胞转化基因的新方法。
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1材料与方法
1.1细胞系、质粒及动物来源
小鼠成纤维细胞系NIH3T3(CRL-1659)购自美国ATCC，人膀胱癌细胞系T24、质粒pKj1-neo、Blur8及pSV2-rasH系本所保存，裸鼠(BALB/c,nu/nu)(4周龄)购自中国科学院上海实验动物中心。
1.2主要试剂
胎牛血清、培养基DMEM、1640均系U.S.A.Hyclone产品,分子生物学试剂如随机引物标记试剂盒、限制性核酸内切酶等购自U.S.A.GIBCO公司，转染试剂盒FuGENTM6系U.S.A.Roche公司产品，同位素α-32P-dCTP(111GBq/mol)系北京亚辉公司产品，其它常用试剂为国产分析纯。
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1.3方法
质粒/真核细胞DNA的提取、酶切、电泳、探针回收以及Southern分析按文献方法进行[3]，人重复序列Alu/H-ras探针标记、细胞转染按各自说明书进行。
2实验结果
2.1肿瘤细胞DNA共转染
将肿瘤细胞T24及NIH3T3细胞DNA各30μg分别与0.3μg质粒pKj1-neo混匀、脂质包埋后，加入到含5×105/平皿(100mm)对数期生长NIH3T3细胞的培养品皿中，6小时后换上含10%胎牛血清DMEM培养基继续培养，72小时后，1∶5稀释，同时加入终浓度400μg/mlG418DMEM完全培养基(含青霉素、链霉素各100U/ml)筛选，十天后见每个平皿长出约300个抗性克隆，两周后，0.1%胰酶消化细胞，并将每组细胞集中(每组抗性克隆数≥1000)，计数后接种于4周龄裸鼠(BALB/c)右腋窝皮下(107/0.5ml/只)。阴性对照即未加质粒pKj1-neoDNA组细胞筛选十天后全部死亡。
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2.2转染细胞致瘤性检测
接种经人膀胱癌细胞T24DNA与标记基因共转染的NIH3T3细胞的三只裸鼠，两周后于接种部位全部长出肿块，见图1。
取裸鼠肿块，作病理学分析，结果均为纤维肉瘤,提示T24细胞基因组中含有使细胞发生恶性变的转化基因。为了证实裸鼠长出之肿块是由于外源性转染了细胞T24转化基因的NIH3T3细胞所诱发，而非裸鼠本身自发所致，从裸鼠肿块细胞中提取DNA与32P标记的人体重复序列Alu探针进行Southern杂交，结果见图2。
图1接种共转染人膀胱癌细胞T24DNA的G418抗性克隆的裸鼠(箭头示肿块)
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图2裸鼠肿块DNA与人重复序列Alu的分子杂交
1Markerλ/HindDNA
2共转染NIH3T3细胞DNA的G418抗性克隆的DNA
3～5裸鼠肿块DNA
从图2中清楚看到接种T24DNA共转染的NIH3T3细胞的三只裸鼠肿块DNA均有Alu序列杂交的区带，说明裸鼠肿块是由于外源性转染了T24细胞转化基因的NIH3T3细胞所诱发。用限制性核酸内切酶BamHI酶解提取的裸鼠肿块DNA，将其与32P标记的H-ras癌基因探针作分子杂交，放射自显影结果见图3。
从图3中可清晰看到在6.6Kb处有与H-ras癌基因杂交带。由此可知，肿瘤细胞T24基因组中存在活化细胞瘤基因H-ras。接种经NIH/3T3细胞的DNA与标记基因共转染的NIH3T3细胞的三只裸鼠，九周均未长出肿块。
, http://www.100md.com
3讨论
本研究以人膀胱癌细胞系T24为实验对象采用肿瘤细胞DNA与选择标记(neo)共转染和裸鼠致瘤性分析，成功地检测其存在活化的细胞转化基因。采用此法来检测和分析细胞转化基因是基于以下理由：首先，以往的瘤基因分析方法，大多数采用以NIH3T3为受体细胞的DNA转染分析，但该方法主要根据外源性DNA导入后的细胞形态转化，即折光性加强和停泊非依赖性生长来检测活化瘤基因，因此主观性强，且未经G418的预筛，不能有效地除去未掺入外源DNA自发转化的NIH3T3细胞。采用与选择标记(neo)DNA进行共转染，经G418预筛获得少量仅掺入和表达外源DNA的NIH3T3细胞去诱导裸鼠致瘤，可增加检测的特异性。其次，文献报道标记基因可增加外源性DNA的掺入，且每个掺入标记基因的细胞约掺入3×103Kb外源性DNA，若有103个G418抗性集落则掺入3×106KbDNA即相当于一个基因组的DNA量，增加其检测有效性[4]，而本方法通过计数可保证每次实验G418抗性集落数。再者，两周后每个G418抗性集落长至约104个细胞，因此，即使致瘤性很弱的细胞群体，也能检测出来。最后，裸鼠致瘤性分析不仅能检测肿瘤中因基因结构突变而活化的瘤基因，而且还可确定具有转化潜能的高度扩增的基因，增加检测的可靠性[1]。因此，本法在确定化学致癌物诱导的肿瘤或转化细胞系的活化瘤基因，以及深入研究瘤基因及其活化方式与肿瘤形成的分子机理方面有着重要意义。
, http://www.100md.com
图3裸鼠肿块DNA与细胞瘤基因H-ras的分子杂交
1Markerλ/HindDNA
2共转染NIH3T3细胞DNA的G418抗性克隆的DNA
3～5裸鼠肿块DNA
基金项目:本课题受国家自然科学基金(编号39470777、3977064)资助
[参考文献]
1，Fasano O, Birnbaum D, Edlund L, et al. New human transforming genes detected by tumorigenicity assay [J]. Mol Cell Biol， 1984， 4 (9)： 1695～ 1705.
, 百拇医药
2，Brown R, Brady G, Mattern J, et al. An alterantive assay system for the detection of transforming genes [J]. Carcinogenesis,1984, 5 (10) ： 1323～ 1328.
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning： A laboratory Mannal [M]. 2nd ed . New York： Cold Spring Harbor, 1989： 456～ 572.
4，Perucho M, Hanahan D, Wigler M. Genetic and physical linkagen of exogenous sequences in transformed cells [J]. Cell, 1980, 22： 309～ 317.
收稿日期:1999-09-22;修回日期:1999-11-12, http://www.100md.com